Perancangan Primer dalam Sekuensing Amplicon 16S rRNA

Dalam kalimat induk, istilah perancangan primer muncul ketika dokumen menjelaskan mengapa gen 16S rRNA sering dipakai dalam sekuensing amplicon. Intinya, gen 16S rRNA memiliki dua sifat yang sangat berguna: ada bagian yang relatif konservatif, dan ada bagian yang variabel. Bagian konservatif inilah yang membantu peneliti merancang primer, sedangkan bagian variabel membantu membedakan kelompok bakteri atau arkea.

Secara sederhana, perancangan primer adalah proses memilih dan membuat urutan DNA pendek yang akan digunakan untuk memulai reaksi PCR. Primer berfungsi seperti “penanda awal” dan “penanda akhir” pada bagian DNA yang ingin diperbanyak. Dalam sekuensing amplicon 16S rRNA, primer dirancang agar menempel pada bagian gen 16S rRNA yang relatif sama pada banyak bakteri atau arkea, sehingga bagian di antara dua primer itu dapat diperbanyak dan kemudian disekuensing.

Apa itu primer?

Primer adalah potongan pendek asam nukleat, biasanya DNA, yang panjangnya sekitar 18–30 nukleotida. Dalam PCR, primer diperlukan karena enzim DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA dari nol. Enzim itu membutuhkan ujung awal yang sudah tersedia, yaitu ujung 3′ dari primer, untuk mulai menambahkan nukleotida baru [Mullis et al. 1986; Innis et al. 1990].

Dalam satu reaksi PCR biasanya digunakan dua primer. Primer pertama disebut forward primer, dan primer kedua disebut reverse primer. Keduanya menempel pada dua sisi wilayah target yang ingin diperbanyak. Wilayah DNA hasil perbanyakan itu disebut amplicon. Jadi, dalam konteks dokumen induk, “sekuensing amplicon” berarti peneliti tidak membaca seluruh DNA komunitas, melainkan hanya membaca potongan tertentu yang sudah diperbanyak dengan PCR.

Jika kita bayangkan gen 16S rRNA sebagai sebuah kalimat panjang, primer adalah dua potongan kecil yang mengenali bagian tertentu dari kalimat itu. PCR kemudian memperbanyak bagian kalimat yang berada di antara kedua potongan tersebut.

Mengapa bagian konservatif penting?

Gen 16S rRNA terdapat pada bakteri dan arkea karena gen ini mengode komponen RNA dari ribosom subunit kecil. Ribosom adalah mesin sel yang membaca informasi genetik dan membantu membuat protein. Karena fungsi ribosom sangat penting, banyak bagian gen 16S rRNA berubah sangat lambat selama evolusi. Bagian yang berubah lambat ini disebut bagian konservatif.

Bagian konservatif penting untuk perancangan primer karena primer harus dapat menempel pada DNA target. Jika suatu bagian gen sangat berbeda-beda antarorganisme, satu primer tidak akan cocok untuk banyak kelompok mikroba. Sebaliknya, jika suatu bagian cukup mirip pada banyak bakteri atau arkea, primer dapat dirancang untuk menempel pada banyak takson sekaligus. Inilah alasan gen 16S rRNA sangat berguna untuk survei komunitas mikroba [Woese and Fox 1977; Lane 1991].

Namun kata “relatif konservatif” perlu dibaca dengan hati-hati. Bagian konservatif bukan berarti identik sempurna pada semua bakteri dan arkea. Masih ada variasi kecil. Variasi kecil ini dapat menyebabkan primer lebih cocok untuk sebagian kelompok mikroba daripada kelompok lain. Akibatnya, hasil sekuensing amplicon dapat mengalami bias primer, yaitu beberapa kelompok mikroba lebih mudah terdeteksi atau lebih banyak teramplifikasi dibandingkan kelompok lain, bukan semata-mata karena jumlahnya lebih banyak di sampel [Klindworth et al. 2013; Parada et al. 2016].

Mengapa bagian variabel juga diperlukan?

Jika hanya ada bagian konservatif, gen 16S rRNA tidak akan banyak membantu membedakan organisme. Yang membuat gen ini berguna untuk identifikasi taksonomi adalah adanya bagian-bagian variabel, yaitu wilayah yang lebih sering berbeda antar kelompok mikroba.

Dalam praktiknya, primer ditempatkan pada daerah yang relatif konservatif, lalu PCR memperbanyak wilayah yang mencakup satu atau beberapa daerah variabel. Misalnya, banyak studi mikrobioma menargetkan wilayah V3–V4 atau V4 dari gen 16S rRNA. Setelah amplicon disekuensing, perbedaan urutan pada wilayah variabel digunakan untuk memperkirakan mikroba apa yang ada dalam sampel.

Jadi, ada keseimbangan penting. Primer perlu menempel pada bagian yang cukup konservatif agar dapat mencakup banyak mikroba. Tetapi bagian yang dibaca harus mengandung variasi yang cukup agar dapat membedakan kelompok taksonomi. Kalimat dalam dokumen induk tepat menempatkan “perancangan primer” di antara dua sifat ini: bagian konservatif membantu primer menempel, sedangkan bagian variabel membantu analisis taksonomi.

Apa yang dirancang dalam perancangan primer?

Perancangan primer bukan sekadar memilih urutan pendek secara acak. Ada beberapa pertimbangan dasar. Primer harus cukup spesifik terhadap target, tetapi dalam survei 16S rRNA biasanya juga cukup luas agar mencakup banyak bakteri atau arkea. Primer juga perlu memiliki suhu leleh atau melting temperature yang sesuai, agar dapat menempel pada DNA target pada suhu PCR yang dipakai. Selain itu, primer sebaiknya tidak mudah membentuk struktur sendiri, seperti hairpin, atau saling menempel dengan primer lain membentuk primer-dimer.

Dalam bentuk sederhana, kecocokan primer dengan target bergantung pada pasangan basa DNA. Basa A berpasangan dengan T, sedangkan G berpasangan dengan C. Jika urutan primer banyak tidak cocok dengan urutan target, terutama dekat ujung 3′ primer, PCR dapat menjadi kurang efisien atau gagal. Karena komunitas mikroba berisi banyak organisme berbeda, perancangan primer 16S sering mencoba memilih urutan yang cocok dengan sebanyak mungkin kelompok target.

Kadang digunakan primer degenerat, yaitu primer yang pada posisi tertentu mengizinkan lebih dari satu jenis basa. Misalnya, kode IUPAC “R” berarti A atau G. Primer degenerat dapat memperluas cakupan terhadap variasi alami pada gen 16S rRNA, tetapi terlalu banyak degenerasi dapat menurunkan spesifisitas atau efisiensi reaksi. Jadi, perancangan primer selalu merupakan kompromi antara cakupan, spesifisitas, efisiensi PCR, dan tujuan penelitian.

Contoh dalam mikrobioma usus rayap

Dalam studi mikrobioma usus rayap, peneliti mungkin ingin mengetahui bakteri dan arkea apa saja yang hidup di usus belakang rayap pemakan kayu. Untuk itu, mereka dapat mengekstraksi DNA dari isi usus, lalu menggunakan primer 16S rRNA. Primer tersebut dirancang agar menempel pada bagian konservatif gen 16S rRNA dari banyak bakteri atau arkea. Setelah PCR, amplicon disekuensing dan dibandingkan dengan basis data referensi.

Dari hasil itu, peneliti dapat membuat gambaran komposisi komunitas: misalnya kelompok bakteri fermentatif, bakteri yang berasosiasi dengan protista, atau arkea metanogen mungkin terdeteksi. Tetapi penting untuk menjaga batas interpretasi. Sekuensing amplicon 16S rRNA biasanya memberi informasi terutama tentang siapa yang ada, bukan langsung membuktikan apa yang sedang dilakukan oleh mikroba tersebut. Untuk fungsi, peneliti memerlukan bukti tambahan, misalnya metagenomik shotgun, metatranskriptomik, metaproteomik, atau eksperimen fisiologis.

Ada juga batas lain. Jika primer yang digunakan kurang cocok dengan suatu kelompok mikroba usus rayap, kelompok itu bisa tampak langka atau bahkan tidak terdeteksi. Maka, ketika membaca hasil studi 16S rRNA, kita perlu bertanya: primer apa yang dipakai, wilayah variabel mana yang ditargetkan, apakah primer itu mencakup bakteri saja atau juga arkea, dan apakah ada kelompok yang mungkin terlewat?

Definisi kerja

Dalam konteks pendahuluan ini, perancangan primer dapat didefinisikan sebagai proses memilih urutan DNA pendek yang akan menempel pada bagian konservatif gen target, seperti gen 16S rRNA, agar wilayah tertentu dapat diperbanyak melalui PCR dan kemudian dianalisis atau disekuensing.

Definisi ini cukup untuk memahami kalimat induk. Gen 16S rRNA berguna bukan hanya karena “ada pada bakteri dan arkea”, tetapi karena susunannya memungkinkan strategi teknis yang kuat: primer dapat dirancang pada bagian yang relatif stabil, lalu bagian yang lebih bervariasi dapat dibaca untuk membedakan takson. Namun strategi ini bukan tanpa bias. Kualitas hasil sekuensing amplicon sangat bergantung pada seberapa baik primer dirancang dan seberapa cocok primer itu dengan komunitas mikroba yang benar-benar ada dalam sampel.

References

Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., & White, T. J. (Eds.). (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press.

Klindworth, A., Pruesse, E., Schweer, T., Peplies, J., Quast, C., Horn, M., & Glöckner, F. O. (2013). Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research, 41(1), e1. https://doi.org/10.1093/nar/gks808

Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In E. Stackebrandt & M. Goodfellow (Eds.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics (pp. 115–175). John Wiley & Sons.

Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., & Erlich, H. (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 51, 263–273. https://doi.org/10.1101/SQB.1986.051.01.032

Parada, A. E., Needham, D. M., & Fuhrman, J. A. (2016). Every base matters: Assessing small subunit rRNA primers for marine microbiomes with mock communities, time series and global field samples. Environmental Microbiology, 18(5), 1403–1414. https://doi.org/10.1111/1462-2920.13023

Woese, C. R., & Fox, G. E. (1977). Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: The primary kingdoms. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(11), 5088–5090. https://doi.org/10.1073/pnas.74.11.5088